Interferencja RNA w medycynie

      Nagrodę Nobla w roku 2006, w dziedzinie fizjologii i medycyny, otrzymali dwaj Amerykanie – Andrew Z. Fire i Craig. C. Mello, za dokonane w 1998 roku odkrycie zjawiska interferencji RNA (w skrócie RNAi – od ang. RNA interference). Choć od tego czasu upłynęło zaledwie kilka lat, interferencja RNA stała się powszechnie wykorzystywanym narzędziem biologii molekularnej, umożliwiającym badanie funkcji genów praktycznie wszystkich organizmów eukariotycznych. Dość szybko okazało się również, że spełnia ona niezwykle ważną rolę w fizjologicznej regulacji działania genów. Wiele wskazuje na to, że dzięki odkryciu możliwe będzie opracowanie nowatorskich metod terapii chorób nowotworowych, wirusowych, a także niektórych chorób genetycznych. Pierwsze leki skonstruowane w oparciu o zjawisko RNAi weszły już w fazę badań klinicznych.

Odkrycie interferencji RNA. Molekularne podstawy zjawiska.  

Jak doszło do odkrycia?

      Proces interferencji RNA (RNAi) opisany został po raz pierwszy u należącego do nicieni robaka z gatunku Caenorhabditis elegans. Odkrycie zjawiska było w pewnej mierze dziełem przypadku. W swoich doświadczeniach, Fire i Mello, chcąc zahamować ekspresję wybranych genów nicienia, stosowali powszechnie używaną w tym celu metodę – tzw. strategię antysensu. W strategii antysensu projektuje się kilkusetnukleotydowe, jednoniciowe cząsteczki RNA (tzw. antysensowny RNA) tak, by były one komplementarne do mRNA genu, którego ekspresja ma zostać zablokowana. Wprowadzenie do wnętrza komórki cząsteczek antysensownego RNA skutkuje z reguły ich przyłączeniem się do komplementarnego mRNA. Uniemożliwia to rybosomom syntezę białka na matrycy takiego mRNA. Nieco wcześniej, bo w 1995 r., Guo i Kemphus opublikowali pracę, w której donosili, iż nie tylko antysensowny, ale także sensowny RNA (czyli o sekwencji identycznej z mRNA) jest zdolny zahamować ekspresję określonego genu C. elegans. Było to obserwacją dość niezwykłą, więc Fire i Mello postanowili, że oprócz używanych w swym eksperymencie antysensowych cząsteczek RNA, ponownie ocenią biologiczną aktywność sensownego RNA, a także sprawdzą dodatkowo działanie mieszaniny obydwu molekuł. Wyniki doświadczenia były zaskakujące. Okazało się, że mieszanina sensownego i antysensownego RNA potrafiła zahamować ekspresję docelowego genu ponad 10-krotnie skuteczniej niż każda pojedyncza nić z osobna. Dalsze badania pokazały, że za ten silny efekt odpowiada dwuniciowy RNA (dsRNA), formujący się spontanicznie po zmieszaniu obu komplementarnych sensownych i antysensownych cząsteczek. Zdolność dsRNA do silnego i swoistego wyciszenia ekspresji danego genu nazwano interferencją RNA. Wkrótce okazało się, że podobne zjawisko zachodzi nie tylko u C. elegans. Zaobserwowano je w komórkach roślin (Arabidopsis thaliana), grzybów (Neurospora crassa), muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz ssaków, w tym także człowieka (Rys. 1).

Rys. 1. Interferencja RNA w komórkach różnych organizmów: a) roślina syntetyzująca transgeniczne białko fluoryzujące na zielono (GFP) – sygnał wyciszający rozprzestrzenia się poprzez system żyłek, w kierunku obwodowych części liścia; zielony kolor pochodzi od fluorescencji GFP, czerwony od fluorescencji chlorofilu, widocznej dopiero po wyciszeniu ekspresji transgenu GFP; b) Transgeniczny C. elegans, wyrażający białko GFP w jądrach komórkowych – po lewej użyto kontrolny dsRNA, po prawej dsRNA specyficzny względem mRNA genu kodującego GFP; zahamowanie syntezy GFP widoczne jest tylko po stronie prawej; c) ludzkie nowotworowe komórki HeLa traktowane siRNA hamującym ekspresję genu ORC6; wyciszenie produkcji białka ORC6 powoduje, że komórki stają się wielojądrowe (DNA wybarwione jest na czerwono, tubulina – na zielono); d) oko dorosłej Drosophila melanogaster – zdjęcie po prawej obrazuje prawidłową czerwoną pigmentację oka; na zdjęciu po lewej zaobserwować można efekt zablokowania syntezy ocznego barwnika przez specyficzny siRNA – oko białe;[Fig. 1-Hannon, G.J. (2002) RNA interference, Nature 418, (244-251)]

W jaki sposób dsRNA hamuje ekspresję genów?

      Po wniknięciu do komórki, długie cząsteczki dsRNA cięte są przez enzym Dicer na, zawierające ok. 21-25 par zasad, fragmenty tzw. krótkiego interferującego RNA – inaczej siRNA (od ang. small interfering RNA) - (Rys. 2). siRNA są następnie wychwytywane przez obecny w komórce specjalny kompleks białkowy, tzw. kompleks wyciszający indukowany przez RNA – w skrócie RISC (ang. RNA-induced silencing complex). Dwuniciowy siRNA podlega rozwinięciu przez zawarte w kompleksie białka, po czym następuje proces degradacji jednej z nici. Aktywny RISC (RISC*), z działającą jako swego rodzaju przewodnik antysensowną, dwudziestokilkunukleotydową nicią siRNA, poszukuje w komórce komplementarnych transkryptów mRNA (Rys. 2). 

Rys. 2. Szlak interferencji RNA – opis w tekście powyżej;
[na podst. Fig. 2-Hannon, G.J. (2002) RNA interference, Nature 418, (244-251)]

      Jeśli RISC* odnajdzie i zwiąże komplementarny mRNA, to jeden z zawartych w kompleksie enzymów (białko z rodziny Argonaute) przecina cząsteczkę mRNA w połowie sekwencji komplementarnej do siRNA. Nie może zatem dojść do produkcji białka, gdyż matryca RNA niezbędna do jego syntezy ulega uszkodzeniu (Rys. 3b). Proces wyciszania ekspresji genów jest niezwykle silny i swoisty. Często dochodzi do całkowitego zablokowania syntezy białka, a niezgodność pojedynczego nukleotydu pomiędzy odpowiadającymi sobie sekwencjami znacząco osłabia efekt, bądź nawet całkowicie go znosi. Powyższy mechanizm wyciszania genów jest powszechny szczególnie u niższych organizmów eukariotycznych, np. C. elegans, D. melanogaster oraz różnych gatunków roślin. Dalsze badania pokazały, że degradacja mRNA jest tylko jednym ze szlaków, przy udziale których, małe RNA (mianem tym określa się wspólnie siRNA oraz tzw. miRNA) potrafią zahamować ekspresję genu. Okazało się, że same siRNA lub ich bliscy „krewni” (wspomniane cząsteczki miRNA), w połączeniu z innym, podobnym do RISC efektorowym kompleksem białkowym (kompleks miRNP), hamują ekspresję genu na poziomie translacji, bez degradowania komplementarnego mRNA. Rybonukleoproteinowy kompleks miRNP osiada na nici mRNA uniemożliwiając rybosomom translację. W opisanym powyżej przypadku, komplementarność obu wiążących się nici (mRNA i miRNA) z reguły nie jest pełna i mogą się one różnić 1-2 nukleotydami. Powyższy mechanizm wyciszenia ekspresji (Rys. 3c) zachodzi głównie w komórkach ssaczych, w tym ludzkich. Oba wspomniane procesy polegają na posttrankrypcyjnym wyciszaniu genu (PTGS, ang. posttrascriptional gene silencing).
      siRNA może prowadzić do wyciszenia genu także na poziomie transkrypcji (TGS, ang. transcriptional gene silencing). Angażując odpowiednią maszynerię białkową, siRNA może odnajdywać w jądrze komórkowym komplementarne sekwencje genów i blokować ich transkrypcję poprzez metylację obszarów promotorowych i zmianę przestrzennej struktury chromatyny (Rys. 3a). Taki, zachodzący na epigenetycznym poziomie, mechanizm regulacji genów opisano dotychczas u roślin (A. Thaliana), (C. Elegans) i (D. Melanogaster). Tłumaczy on, dlaczego zahamowanie ekspresji genów może zostać odziedziczone i wystąpić również u potomstwa organizmów, którym wstrzyknięto siRNA.

Rys. 3. Różne szlaki interferencji RNA w komórce; a) wyciszanie ekspresji na poziomie transkrypcji poprzez metylację obszarów promotorowych genów; b) wyciszenie ekspresji genu przez degradację mRNA; c) wyciszenie ekspresji genu poprzez zablokowanie translacji (szlak zależny od miRNA);
[na podst. Fig. 2-Fjose, A. (2006) RNAi and MicroRNAs: From Animal Models to Disease Therapy, Birth Defects Research (part C), (150-171)]

Zastosowanie siRNA w terapii chorób człowieka

      Swoistość i siła działania cząsteczek siRNA sprawiły, że bardzo szybko podjęte zostały próby wykorzystania ich biologicznej aktywności do zahamowania ekspresji genów „powodujących choroby”. Badania początkowo ukierunkowane były przede wszystkim na terapię infekcji wirusowych, nowotworów złośliwych i chorób neurodegeneracyjnych. Później do listy dołączyły także choroby alergiczne, autoimmunologiczne, cukrzyca oraz zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD).

      Kilka grup naukowców udowodniło, że siRNA potrafi blokować replikację wielu ludzkich chorobotwórczych wirusów RNA i DNA, w różnych momentach ich życiowego cyklu. W badaniach in vitro, przeprowadzanych na komórkach ludzkich, a także in vivo na modelach zwierzęcych, udało się zahamować replikację wirusa HIV, poliomyelitis, grypy, paragrypy, RSV, wirusów zapalenia wątroby typu B i C (HBV i HCV) i coronawirusa związanego z SARS. W przypadku wirusa RSV, najczęstszego czynnika etiologicznego zapalenia oskrzeli u niemowląt, testy aerozolu zawierającego przeciwwirusowe siRNA, weszły w I fazę badań klinicznych. Inne strategie wykorzystujące siRNA polegają na zablokowaniu ekspresji komórkowych receptorów lub koreceptorów wirusa, uniemożliwiając mu wniknięcie do wnętrza komórek gospodarza. Metoda okazała się być skuteczna in vitro w stosunku do HIV. O ile trudno sobie wyobrazić próby zniesienia ekspresji receptora CD4 w limfocytach in vivo, o tyle zablokowanie syntezy koreceptorów CCR5 czy CXCR4 wydaje się być podejściem całkiem realnym, tym bardziej, że naturalnie występujące w ludzkiej populacji homozygoty CCR5(-/-) są zdrowymi, opornymi na zakażenie HIV osobnikami.

      Opisanych zostało wiele skutecznych prób zmierzających do zahamowania proliferacji komórek nowotworowych przy użyciu swoistych cząsteczek siRNA. Badania prowadzone były in vitro na hodowlach komórkowych. Kilka z nich polegało na wyciszeniu ekspresji onkogenów, czyli białek indukujących niekontrolowane podziały komórki. Wyróżnia się dwa rodzaje onkogenów: onkogeny wirusowe i komórkowe. Przykładem onkogenów pochodzenia wirusowego są białka E6 i E7, kodowane przez niektóre typy ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV). Jeśli dojdzie do infekcji kobiecych dróg rodnych wirusem HPV, onkogeny E6 i E7 mogą indukować rozwój raka szyki macicy. Zablokowanie ich ekspresji zapobiega transformacji nowotworowej lub zmniejsza tempo podziału komórek już istniejącego guza. Protoonkogeny, które w prawidłowych warunkach kontrolują podziały i różnicowanie komórek, mogą ulegać mutacjom i przekształcać się we wspomniane wyżej onkogeny komórkowe.  Są nimi np. onkogen K-ras zmutowany w rakach przewodu pokarmowego, czy onkogen BCR/ABL w przewlekłej białaczce szpikowej (CML). Wyciszenie ich ekspresji pozwala zahamować podziały komórek nowotworowych, a także indukuje w nich apoptozę, co łącznie redukuje masę guza. Obiecujące wyniki otrzymano stosując siRNA przeciwko ludzkiej telomerazie (hTR) – enzymowi dającemu komórkom nowotworowym zdolność do przeprowadzenia nieograniczonej liczby podziałów, a także blokując syntezę czynników wzrostowych np. EGF i VEGF. Pierwszy z nich stymuluje rozwój nowotworów nabłonkowych, drugi natomiast indukuje wzrost naczyń krwionośnych guza.

      W niektórych, dziedziczących się w sposób dominujący, zaburzeniach neurodegeneracyjnych, wystąpienie choroby związane jest z gromadzeniem się wewnątrz neuronów toksycznego, zmutowanego białka. Tak dzieje się w chorobie Huntingtona czy typie 1 ataksji rdzeniowo-móżdżkowej. W badaniach na modelach mysich, zastosowanie cząsteczek siRNA, swoiście hamujących syntezę nieprawidłowych białek, łagodziło objawy choroby oraz prowadziło do cofania się zmian degeneracyjnych na poziomie mikroskopowym. 

Najbardziej zaawansowane są próby wdrożenia siRNA do leczenia związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej (AMD). Choroba dotyka osoby po 50-60 roku życia i jest jedną z najczęstszych przyczyn nieodwracalnej ślepoty wśród społeczeństw krajów rozwiniętych. W przebiegu choroby dochodzi do wzmożonej sekrecji czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF), który stymuluje tworzenie się patologicznych naczyń w siatkówce oraz błonie naczyniowej oka i doprowadza do utraty widzenia centralnego. Podobne mechanizmy patogenetyczne leżą także u podstaw rozwoju niedowidzenia będącego powikłaniem przewlekłej cukrzycy. W I fazie badań klinicznych znajdują się dwie potencjalnie lecznicze cząsteczki siRNA, jedna, Cand5 skierowana przeciwko mRNA genu kodującego VEGF, druga – Sirna-027, hamująca ekspresję receptora typu 1 dla VEGF (VEGFR1). Po iniekcji doszklistkowej lub pozagałkowej, oba leki znacząco hamują proces powstawania nowych naczyń (neowaskularyzację), a efekt działania utrzymuje się od 3 do 5 dni (Rys. 4).

Rys. 4. Sirna-027 (opis w tekście) hamuje siatkówkową neowaskularyzację w oku myszy: a) kontrola – strzałki wskazują nieprawidłowe naczynia powstałe w siatkówce oka; b) po doszklistkowej iniekcji 1ug siRNA zaobserwowano znaczący spadek siatkówkowej neowaskularyzacji.
[Fig. 8 – Shen, J. (2006) Suppression of ocular neovascularization with siRNA targeting VEGF receptor 1, Gene Therapy 13, (225-234)]

O ile miejscowe sposoby podania siRNA, np. w postaci aerozolu do drzewa oskrzelowego, czy okołogałkowych iniekcji, są łatwe, i jak pokazują wstępne badania – skuteczne, o tyle leczenie systemowe oraz narządowo swoiste napotyka na pewne problemy. Jednym z nich jest krótki czas półtrwania siRNA w organizmie. Wynika on z faktu, że enzymy rozkładające RNA obecne są we wszystkich płynach ustrojowych. By zapobiec zniszczeniu molekuł, próbuje się je łączyć z białkami ochronnymi lub wprowadzać do wnętrza cząsteczek modyfikacje chemiczne, dające większą oporność na degradację. Kierowanie terapeutycznych małych RNA do miejsca ich przeznaczenia jest możliwe dzięki sprzęganiu z cząsteczkami „przewodnikowymi”, swoiście rozpoznającymi receptory danego narządu lub tkanki. W przypadku prób terapii chorób wirusowych pewien kłopot stanowi szybkie tempo mutacji genomu patogena, które sprawia, że wirus często wymyka się spod, hamującego jego replikację, wpływu siRNA. Rozwiązaniem mogą się okazać „koktajle” z wielu siRNA, zwłaszcza skierowanych przeciwko konserwowanym ewolucyjnie sekwencjom nukleotydowym wirusa. Choć wiele problemów, związanych z projektowaniem oraz wybiórczym dostarczaniem siRNA do konkretnych komórek, tkanek bądź narządów, pozostaje nadal nierozwiązanych, prace trwają i istnieje realna szansa, że już niedługo klasa całkiem nowych, oligonukleotydowych leków znajdzie swoje miejsce na farmaceutycznym rynku. 

Opracował - lek., mgr biol. Aleksander Jamsheer

Komórki macierzyste z ludzkich zarodków mogą dać poczatek plemnikom i komórkom jajowym w laboratorium - o brytyjskim eksperymencie donosi serwis internetowy EurekAlert.

Zarodkowe komórki macierzyste to najbardziej wszechstronne komórki, jakie znamy, ponieważ mogą dać początek wszystkim tkankom naszego organizmu. Naukowcy liczą, że dzięki tym zdolnościom można je będzie pewnego dnia wykorzystać w medycynie - do wymiany różnych tkanek zniszczonych przez uraz czy chorobę. Aby do tego doszło, trzeba jednak znaleźć sposób, by zmusić komórki macierzyste do rozwoju w daną tkankę. Całkiem niedawno z mysich komórek macierzystych udało się uzyskać w laboratorium komórki rozrodcze - jaja i plemniki.

Obecnie badacze z Uniwersytetu w Sheffield w Wielkiej Brytanii postanowili powtórzyć ten sukces na komórkach ludzkich. Hodowali ludzkie zarodkowe komórki macierzyste in vitro i analizowali, jakie geny są w nich aktywne. W ciągu dwóch tygodni w bardzo małej grupce komórek uaktywniły się geny typowe dla komórek, z których rozwijają się gamety. Później, w niektórych obserwowano nawet aktywność genów specyficzną dla plemników.

Zdaniem badaczy, oznacza to, że zarodkowe komórki macierzyste człowieka mogą dać w laboratorium początek komórkom zarodkowym - jajom i plemnikom. Ale zanim do tego dojdzie naukowców czeka bardzo dużo pracy. Wyprodukowanie czynnych komórek rozrodczych jest bardzo trudne. Najpierw trzeba odtworzyć komórkom środowisko, w którym rozwijają się naturalnie, tak jak w organiźmie. W przypadku komórek jajowych są to warunki panujące w jajnikach, a w przypadku plemników - w jądrach.